1. INTRODUCTION 
Tous les organismes vivants sont le siège d’échanges
permanents avec le milieu dans lequel ils évoluent. Les plantes,
par exemple, assimilent, grâce à la photosynthèse,
le dioxyde de carbone, utilisé pour la formation de substances
aussi complexes que des sucres, des lipides ou des protéines.
Les cellules elles-mêmes peuvent être considérées
comme des entités où se produisent des phénomènes
d'assimilation et de transformation, donnant lieu à de nouveaux
substrats repris à leur tour par des “organes”
intracellulaires (les organelles), l’ensemble de ces phénomènes
aboutissant, in fine, à la production d’un nombre considérable
de molécules organiques. Ces molécules sont alors utilisées
à des fins très diverses. En particulier, elles servent
au renouvellement des éléments vieillissants de l’organisme
dont toutes les molécules, y compris celles entrant dans la
composition du squelette chez les animaux, ont une vie “programmée”
dont la durée dépend de leur nature même. Au stade
ultime de ces processus, les éléments arrivés
au terme de leur durée de vie devront être remplacés.
Les molécules qui les constituent subiront alors de nouvelles
transformations aboutissant à des corps simples, essentiellement
du dioxyde de carbone, de l’eau et de l’urée, que
l’organisme éliminera au gré de leur production.
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2. UN EQUILIBRE “
DYNAMIQUE ”
Tous ces processus sont des événements dynamiques :
bien qu’elles soient toutes soumises à un renouvellement
permanent, les molécules de même nature sont généralement
présentes en quantité sensiblement constante au cours
du temps dans la plupart des organismes. Si l’on suit la concentration
de telle ou telle molécule, aucune variation sensible n'est
observée. Et pourtant dans cette population, certaines viennent
d'être synthétisées, d'autres sont dégradées.
Pour décrire ce phénomène, on dit que ces molécules
sont en “ équilibre dynamique ”.
Avant l’arrivée des radioéléments, pour
appréhender les relations entre des ensembles moléculaires,
il fallait rompre ces relations par un artifice quelconque pour parvenir
à modifier leur concentration. Une méthode a longtemps
consisté à créer un déséquilibre
dans l’organisme (on ôtait une glande, on interrompait
le trajet d’un nerf), puis à en rechercher les conséquences
sur les autres composantes accessibles à la mesure, dans le
sang par exemple. C’est le principe de la méthode expérimentale
introduite par Claude Bernard, qui a donné naissance, avec
les succès que l’on connaît, à la physiologie.
Cette discipline vise à définir les processus biologiques
en termes fonctionnels (comment ça marche ?), et tente de répondre
à la question fondamentale : à quoi ça sert ?
Par là, elle cherche à comprendre l’essence même
de la vie, par l’analyse des différents processus qui
caractérisent un organisme vivant. Comme le prévoyait
avec une remarquable intuition Frédéric Joliot, dès
sa découverte des radioéléments artificiels,
cette discipline devait largement bénéficier et bénéficie
toujours de la puissance du marquage isotopique.
Comment étudier un système sans en perturber l'équilibre
? C’est là que les marqueurs radioactifs, qui permettent
de suivre, à la trace, le devenir dans l’espace et le
temps de chaque espèce moléculaire, ont révolutionné
la démarche des biologistes (document 1). Grâce
aux marqueurs, non seulement les études complexes décrites
précédemment ont pu être abordées, mais
de nombreuses applications nouvelles ont vu le jour. Pourquoi ? Tout
simplement parce que les isotopes radioactifs se comportent dans l’organisme
de manière chimiquement identique aux atomes stables préexistant
: le 14C, un émetteur b-,
se comportera comme le 12C, élément stable,
et le 24Na, un autre émetteur b-,
comme le 23Na, stable.
De même que le baguage des oiseaux permet de déterminer
leurs aires de répartition, leurs voies de migration et leur
durée de vie dans les conditions naturelles, le marquage isotopique
permet de détecter une molécule dans un mélange
complexe, de la doser par les méthodes de comptage, et même
de visualiser son devenir dans un organisme, un organe, une cellule,
une organelle, grâce aux clichés radio autoradiographiques
(document 2).
L’utilisation des marqueurs radioactifs a ainsi révolutionné
la biologie. Les quelques exemples ci-dessous ne peuvent offrir qu'une
vision très incomplète de l'apport des isotopes dans
les sciences du vivant, tant la diversité des méthodes
et des concepts générés est étendue. Nous
aborderons trois domaines pour lesquels le marquage isotopique fut
déterminant : la notion de compartimentation et de répartition
des molécules dans un organisme vivant, la durée de
vie biologique d'une molécule ou d'une cellule, la détermination
des interactions et des échanges chimiques conditionnant le
fonctionnement du vivant.
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3. ANONYME DANS LA FOULE
MAIS TOUJOURS IDENTIFIABLE
Revenons à nos molécules en “ équilibre
dynamique ”. Qu’est-ce qui intéresse le physiologiste
? Il voudra, par exemple, savoir si toutes les molécules de
même nature ont la même destinée dans un organisme,
c’est-à-dire si elles constituent un ou plusieurs groupes
distincts, traquer l’existence d’échanges éventuels
entre ces différents groupes et mesurer l’intensité
de ces échanges.
Une “ population ” moléculaire se trouve rarement
confinée dans un espace bien défini. On en retrouve
généralement des représentants dans chaque partie
de l’organisme. On peut les dénombrer et même les
classer en plusieurs “ sous-populations ”. En effet, avec
les marqueurs radioactifs, il est possible de reconnaître une
“ sous-population ” formée par un ensemble de molécules
qui ont une probabilité égale de subir un événement
donné. Chacun de ces ensembles occupe un espace (un “
pool ” ou “ compartiment ”) qui est le plus souvent
de nature virtuelle mais dont la taille est néanmoins
mesurable. On pourra ainsi détecter plusieurs de ces
“ sous-populations ” si la molécule subit des événements
de probabilité différente. Cette notion, de prime abord
quelque peu ésotérique, recouvre une réalité
aisée à comprendre. En reprenant l'analogie des oiseaux,
le baguage d'une population homogène sur le plan morphologique
a souvent conduit à la découverte de sous-populations
se distinguant par leur comportement ou leur durée de vie,
propriétés souvent liées à des habitats
différents au sein d’une même aire géographique.
Revenons à nos molécules. Si, par exemple, on injecte
une petite quantité d’eau tritiée à un
lapin, on observe que la concentration sanguine en 3H évolue
en fonction du temps selon une fonction exponentielle complexe qui
semble tendre vers une valeur d’équilibre, à l’échelle
de temps considérée (document 3). Cette évolution
traduit le passage de l’eau tritiée du compartiment sanguin
où il a été introduit, vers le milieu intersticiel,
c’est-à-dire vers les espaces qui entourent les cellules
de l’ensemble de l’organisme, puis son entrée dans
les cellules. L’analyse de l’évolution de la radioactivité
spécifique de l’eau plasmatique (c’est-à-dire
la radioactivité en 3H par l’unité
de volume choisie) au cours du temps pourra nous renseigner sur l’intensité
des échanges entre ces trois compartiments ainsi que sur leurs
tailles respectives
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4. LA DUREE DE VIE D’UNE
MOLECULE
Que se passe-t-il quelques instants plus tard, lorsque la radioactivité
spécifique de l’eau tritiée est devenue homogène
dans tous les territoires de l’organisme ? La situation reste
intéressante. En effet, l’évolution de la radioactivité
spécifique ne dépendra plus que de l’élimination
de l’eau tritiée dans le milieu extérieur et
de son remplacement simultané en quantité égale
par de l’eau non marquée. Dans ce cas, l’organisme
tout entier deviendra un unique compartiment. La radioactivité
de l’eau tritiée décroîtra dans le sang
selon une exponentielle simple qui tendra vers zéro.
Par analogie à la période radioactive, les biologistes
ont défini une “ période biologique ”,
mesurée par le temps nécessaire pour que la radioactivité
spécifique des constituants de l’organisme ait diminué
de moitié. La résolution mathématique de la
décroissance exponentielle, après correction éventuelle
de la décroissance radioactive résultant de la période
physique de l’isotope, montre que la période biologique
correspond à la durée nécessaire pour que 69
% des constituants considérés aient été
renouvelés(1) . Chez l’Homme, la période
biologique de l’eau est de six à neuf jours, suivant
les individus et les apports quotidiens.
Ce type d’investigation ne s’applique pas qu’aux
atomes ou molécules. Imaginons que dans un organisme, on
puisse marquer irréversiblement un type cellulaire donné
à l’aide d’un radioélément. La
disparition progressive des cellules fera décroître
la radioactivité de cette population. A terme, toutes les
cellules marquées auront disparu. L’évolution
de la radioactivité spécifique de ce “ compartiment
” cellulaire (ici l’intensité de la radioactivité
d’une quantité donnée de cellules) décrira
donc une exponentielle simple qui tendra vers zéro. On pourra
ainsi calculer la durée de vie moyenne de cette population
cellulaire. C’est de la sorte que l’on a mesuré
la durée de vie de nos globules rouges, qui est de 120 jours,
ce qui signifie que nous fabriquons, pour remplacer les défaillants,
2.1011 globules rouges quotidiennement. Cette méthode est
particulièrement utile lorsque l’on se trouve en présence
de populations comptant une multitude d’individus, sur lesquelles
une approche statistique prend tout son sens.
(1) Soit C la radioactivité mesurée
dans le prélèvement au temps t : C=C0 e-kt
(a) si le système est en état stationnaire pendant
la période d’observation, au bout d’une période
biologique T, la nouvelle concentration C’ sera égale
à C/ 2 : C’ = C0 / 2 = C0 e-k(t+T)
(b) Le rapport (a)/(b) ===> 2 = e-kt/ e-k(t+T)
= ekT soit : kT = Log2 = 0,69, ce qui signifie qu’au
cours d’une période biologique, 69 % des molécules
de l’organisme se sont renouvelées.
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5. ET SON DEVENIR DANS
LA CELLULE
Initialement conçue pour décrire l'inventaire des constituants
d'une cellule vivante, la biochimie s'est peu à peu étendue
à l'étude de leurs transformations, et à la caractérisation
des facteurs qui les catalysent et les régulent pour tendre
à une stabilité du milieu intérieur. Les systèmes
biologiques sont caractérisés par leur complexité
et la nécessité de détecter et de doser des substances
présentes à de très faibles concentrations au
milieu de nombreux composés de nature chimique très
voisine. Le marquage isotopique a permis dès les années
40, avec la découverte de la radioactivité artificielle
et la production d'isotopes radioactifs d'atomes abondants dans les
molécules organiques (comme le 14C), d'explorer
la chimie du vivant. Grâce aux marqueurs, on peut déterminer
l'origine des atomes présents dans une molécule donnée
et décrire leur devenir lorsque la molécule est transformée,
jusqu'à son élimination par la cellule ou l'organisme.
Notons en passant que deux éléments ont été
déterminants, et continuent de l'être, pour étudier
les réactions chimiques survenant dans une cellule vivante
: la maîtrise du marquage, qui conditionne la possibilité
d'introduire des atomes radioactifs en des positions définies
dans des molécules biologiques, et la sensibilité des
systèmes de détection. Les méthodes d’explorations
sont nombreuses.
Une des plus utilisées, dite de pulse chase, consiste
à fournir à des cellules un élément radioactif
(période de pulse) puis à les cultiver en présence
du même substrat non marqué (période de chase).
C'est ce que firent, au début des années 1950, Andrew
Benson et Melvin Calvin en cultivant des algues unicellulaires en
présence de 14CO2. Le 14C
se retrouvait dans les différents constituants cellulaires
formés au cours de la photosynthèse. En les analysant
par chromatographie, et en utilisant différents temps de marquage,
ils purent suivre le devenir du carbone dans la cellule végétale.
Ces travaux fondamentaux, réalisés à Berkeley
de 1948 à 1957, ont permis, grâce à l'utilisation
de carbone 14 et de phosphore 32, de déterminer l'ensemble
des réactions biochimiques intervenant entre le moment où
le carbone pénètre dans la cellule végétale
sous forme de gaz carbonique et celui où on le retrouve stocké
sous forme d'amidon (document 4). A la même époque,
Hans Krebs mettait en oeuvre une autre méthode, dite de "compétition
isotopique", classique aujourd’hui, pour analyser le métabolisme
du carbone chez les bactéries et les animaux. Le principe consiste
cette fois-ci à marquer l’ensemble des constituants cellulaires,
en cultivant par exemple les bactéries sur un milieu ne contenant
que du glucose uniformément marqué au 14C
comme seule source de carbone. Un seul type de précurseur,
non marqué cette fois-ci, est ensuite ajouté au milieu
de culture. Si ce précurseur est utilisé par la cellule,
on verra alors décroître progressivement la radioactivité
spécifique de la molécule dont elle est issue. C'est
essentiellement par ces deux méthodes complémentaires,
la technique de pulse chase et la compétition isotopique,
que la quasi-totalité des voies métaboliques du vivant
ont pu être recensées au cours des cinquante dernières
années.
L'utilisation du phosphore 32 et du soufre 35 a également été,
dans les années 1940-50, à l'origine de la caractérisation
de l’ADN, le matériel génétique des chromosomes,
et a permis, dans les années 1960, de comprendre la façon
dont ce matériel régit le fonctionnement cellulaire
: détermination du code génétique, synthèse
des protéines, régulation de l’activité
des gènes. En 1977, Frederic Sanger(2) inventait
une technique permettant le séquençage de l'ADN, c'est-à-dire
l'analyse séquentielle de ses constituants élémentaires,
qui allait ouvrir la voie à la lecture des génomes.
Là aussi, le marquage joua un rôle tout à fait
essentiel (document 5).
C'est aussi la chimie des communications entre cellules et entre tissus
qui a pu être abordée par le marquage. Le marquage radioactif
des hormones, par exemple, a permis d'isoler leurs récepteurs,
molécules situées à la surface de la cellule
sur lesquels l'hormone, en venant se fixer, déclenche une réponse
physiologique. Les laboratoires de chimie et de biologie du CEA ont
d'ailleurs joué dans les domaines de l'endocrinologie, des
neurorécepteurs, de la génétique, des échanges
cellulaires un rôle déterminant au cours des dernières
décennies et continuent de tenir leur rang.
Enfin, rappelons qu'au CEA, un laboratoire d'imagerie médicale,
le Service Hospitalier Frédéric Joliot, a vu le jour
en 1958 à l'hôpital d'Orsay. Aujourd'hui, ce laboratoire
est devenu un centre leader dans son domaine. Les radioéléments
et les techniques de détections associées ont permis
de développer des techniques d'imagerie d'organes sains ou
pathologiques de plus en plus raffinées. Avec la mise en œuvre
de gamma caméras, de tomographe à positons ou d'imagerie
par résonnance magnétique, on obtient aujourd'hui des
images d'organes en trois dimensions en temps réel. Obtenues
en l'absence de tout traumatisme, ces images sont des informations
primordiales pour l'élaboration d'un diagnostic, qui délimitent
avec précision le champ d'intervention du chirurgien et qui
permettent de suivre l'efficacité du traitement thérapeutique.
Cette imagerie donne lieu à une foule d'applications dans des
pathologies comme la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer,
la schizophrénie, l'épilepsie, la dépression
nerveuse, pour ne citer que les plus marquantes se rapportant aux
fonctions cérébrales.
Tout aussi fondamentales sont les toutes nouvelles applications de
cette imagerie dans le domaine des fonctions cognitives car elles
révèlent aussi l'activité du cerveau.(Document
6) On sait dire maintenant quelles zones du cerveau sont actives,
ou inactives, lors d'une opération mettant en jeu l'un de nos
cinq sens ou lors d'une opération mentale. On peut ainsi mettre
en évidence les zones qui participent au langage, (langue maternelle,
langues étrangères, langage des signes), au calcul mathématique,
aux dons, celles qui rendent compte de la mémoire, des images
mentales (gustatives, olfactives, visuelles, auditives, tactiles),
à la pensée…
(2) F. Sanger, déjà prix Nobel en 1958 pour la mise
au point d'une méthode d'analyse biochimique des protéines,
reçut un second prix Nobel en 1980 pour sa méthode de
séquençage de l'ADN. Il faut noter que Hans Krebs et
Melvin Calvin furent également lauréats du prix Nobel
pour leurs découvertes, respectivement en 1953 et 1961. |
6. CONCLUSIONS
Au-delà des quelques exemples que l'on vient de citer, on constate
que les techniques d'exploration basées sur l'emploi de traceurs
rendent et continueront de rendre pendant encore de longues années
des services irremplaçables. Leur immense mérite vient
du fait qu’ils permettent d’explorer l'intérieur
de ces obscures “ boîtes noires ” que sont les organismes,
les organes, et les molécules complexes du vivant. Les mêmes
méthodes sont également mises en oeuvre pour l'étude
des flux de matière et des interactions au sein d'une population
bactérienne, végétale, animale ou au sein d'écosystèmes
complets. Cette exploration permet d’établir des relations
fonctionnelles au cours des divers processus physico-chimiques, des
divers échanges que connaît l’entité considérée.
Elle permet aussi d’explorer, sans aucun a priori, le comportement
de molécules nouvelles dans les organismes lorsque l’on
souhaite connaître leur distribution, leur durée de vie
et leurs transformations chimiques. Ces études sont particulièrement
indispensables dans le cas des médicaments dont il est nécessaire
de décrire chacune des étapes de leur métabolisme
afin, entre autres objectifs, d’en prévoir les éventuels
effets secondaires.
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DOCUMENT 1
Principe d’utilisation des radioéléments
Les composants des systèmes biologiques font l’objet
de transformations chimiques ou d’échanges permanents
sans transformation chimique. Les radioéléments permettent
de mesurer les paramètres qui décrivent ces processus
cinétiques, notamment leur intensité et le nombre de
molécules impliquées. Leur emploi repose sur les principes
suivants :
1) La molécule marquée doit être chimiquement
pure. Cela est particulièrement crucial pour les molécules
organiques et plus particulièrement celles marquées
au tritium, qui peuvent subir une radiolyse plus ou moins importante
selon leur radioactivité spécifique, c’est-à-dire
selon l’intensité de la radioactivité par gramme
(ou molécule) de l’élément stable. En fin
d’expérience, lors de l’exploration d’un
processus cinétique, il faut s’assurer que la molécule
n’a pas subi de transformation chimique au cours du processus.
2) Le système doit être à l'état stationnaire
: la valeur de chacune des variables qui définit le système
ne doit pas varier de façon significative pendant la durée
de l’expérience. La quantité de l’élément
marqué doit donc être négligeable devant la masse
de l’élément non marqué contenue dans le
compartiment où il est introduit. De même, l’échantillon
doit avoir une taille négligeable par rapport à celle
du compartiment où il est prélevé.
3) Le compartiment dans lequel s’effectuent les prélèvements
doit être homogène ; autrement dit, l’échantillon
doit être représentatif de ce compartiment.
4) L’introduction de la molécule marquée et le
prélèvement des échantillons doivent être
rapides par rapport au processus cinétique exploré.
Au cours de l’évaluation d’un processus cinétique
séparant deux compartiments, les radio-éléments
intègrent un certain nombre d’événements
cinétiques intermédiaires, ce nombre dépendant
de la vitesse de variation de la radioactivité spécifique
du radioélément par rapport à la durée
de la période d‘observation. On voit donc par là
que la méthode ne préjuge en rien des mécanismes
biologiques mis en jeu au cours du processus cinétique, elle
n’en fait qu’une description fonctionnelle.
(d’après le cours sur « l’utilisation
des radioéléments en biologie », par F. Morel,
à l’INSTN). |
DOCUMENT 2
Autoradiographie en microscopie électronique d'une cellule
épithéliale provenant d’un animal auquel de
la thymidine tritiée a été administrée
quatre jours auparavant.
L’incorporation de thymidine tritiée dans le noyau,
résulte d’une synthèse d’ADN utilisant
cette base nucléotidique. Elle signe l’apparition d’une
cellule nouvellement formée.
(M. Chrétien et M. Pisam, Biol. of the Cell, 56, 137-150,1986.)
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DOCUMENT 3
Dans l’exemple ci-dessous, la radioactivité du sang d’un
lapin a été suivie après l’injection intraveineuse
de 3µCi d’eau tritiée. On voit que l’expression
de C en fonction du temps décrit deux termes exponentiels successifs.
En exprimant le Log(C-Ceq) en fonction du temps, les points expérimentaux
du second terme exponentiel s’inscrivent sur une droite du type
y = -k2.t.Loge + LogC2 qui permet d’obtenir k2 et C2, Ceq étant
estimée à partir des données expérimentales.
Puis on porte ensuite le logn(C-C2) en fonction du temps pour calculer
C1 et k1.
En divisant C2 par la radioactivité injectée, on obtient
la taille du compartiment intracellulaire (soit 65 % de la masse corporelle)
et à partir de k2 une vitesse de renouvellement de 13 % de
l’eau de ce compartiment par minute, puis par un calcul similaire,
on obtient la taille du compartiment extracellulaire (de l’ordre
de 24 %) et la vitesse de renouvellement de l’eau de ce même
compartiment (de 63% par minute). La fréquence des prélèvements,
imposée par les conditions de l’expérience, ne
permet pas d’apprécier les caractéristiques cinétiques
de la distribution de l’eau tritiée dans le compartiment
vasculaire en raison de la rapidité des échanges entre
l’eau de ce compartiment et celle du compartiment extracellulaire.
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DOCUMENT 4
Autoradiographie d'un gel de séquence d'ADN
La technique dite de pulse chase consiste à mettre des
cellules ou des extraits cellulaires en présence d’un
substrat marqué pendant quelques minutes (phase de pulse)
puis, après lavage, en présence de la même molécule
non marquée (phase de chase). La détermination
des molécules ayant incorporé les atomes radioactifs
et du degré d’incorporation, autrement dit leur radioactivité
spécifique, permet de reconstituer les voies métaboliques,
c’est-à-dire la cascade d’évènements
biochimiques dans laquelle s’intègre le substrat. L’application
de cette technique aux végétaux (utilisation successive
de 14CO2 puis de 12CO2)
a par exemple permis à l'équipe de biochimistes animée
par Benson et Calvin, à Berkeley, de déterminer que
l'acide 3-phosphoglycérique est la première molécule
organique formée à partir du CO2 chez un
grand nombre de végétaux, allant des algues vertes aux
végétaux supérieurs. Cette molécule à
trois atomes de carbone (on parle de métabolisme en C3) sert
ensuite à la synthèse de molécules plus complexes.
Cette réaction, essentielle à la vie, est catalysée
par la ribulose-bisphosphate carbolyse/oxygénase, l'enzyme
la plus abondante sur la planète. .En 1966, quelques années
après Benson et Calvin, Hatch et Slack découvraient
chez la canne à sucre une seconde voie d'incorporation du dioxyde
de carbone dans une molécule organique lors de la photosynthèse.
Les premières molécules formées sont ici des
molécules à quatre atomes de carbone, comme l'oxalo-acétate
(métabolisme en C4). La figure présente la séquence
des produits en C4 formés au cours de la photosynthèse.
Cette séquence est obtenue par reconstitution, en attribuant
des durées variables aux périodes de pulse et de chase.
Ces deux voies biochimiques, métabolisme en C3 et en C4, constituent
les deux grandes formes connues d'assimilation du dioxyde de carbone
lors de la photosynthèse chez les végétaux, ce
sont deux réactions essentielles pour l'ensemble de la vie
sur Terre.
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DOCUMENT 5
Greffe de tissu fœtal chez un patient atteint de la maladie de
Parkinson
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DOCUMENT 6
Les différentes aires du langage.
Les aires colorées montrent les zones du cerveau activées
lorsque le sujet est soumis à une série de tests auditifs.
De haut en bas : le sujet écoute une histoire dans un langage
qui lui est incompréhensible. Il n'entend que des sons sans
signification : seules les aires auditives, situées dans les
lobes temporaux droit et gauche, sont activées.
On le soumet à une liste de mots sans liens, mais en français,
dans sa langue maternelle. Il reconnaît ces mots : une zone
spécifique s'active, située à gauche. Cette aire
(aire de Broca) met en jeu des processus lexicaux qui permettent de
donner une signification à ces sons particuliers que sont les
mots. C'est en quelque sorte notre dictionnaire.
Si on raconte une histoire en français au sujet, on voit que
d'autres aires du cerveau, en plus des précédentes,
sont activées. La plupart de ces aires sont situées
à gauche, celles situées au niveau temporal sont des
zones qui donnent leur sens aux associations de mots que sont les
phrases.
(Document CEA/SHFJ ,Orsay LPSC, INSERM, CNRS & EHSS, Paris) |
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